Вступ до 5-основного (5-base) рішення Illumina

Анотація

5-основне (5-base) рішення Illumina забезпечує оптимізований наскрізний (end-to-end) робочий процес підготовки бібліотек для NGS та аналізу даних, призначений для одночасного профілювання метилювання та високоточного визначення генетичних варіантів.

Спеціально розроблений фермент Illumina використовується для перетворення метильованих цитозинів (5mC) на тимін за умови збереження неметильованих цитозинів, що максимізує якість вирівнювання та забезпечує 5-основне зчитування A, G, C, T і 5mC з кожного секвенувального ріду.

Робочий процес включає менше одного дня підготовки бібліотек, після чого виконується стандартне секвенування Illumina та надшвидкий вторинний dual-omic аналіз DRAGEN тривалістю менше однієї години; процес є сумісним із таргетним збагаченням.

Ранні етапи тестування демонструють, що 5-основне рішення Illumina забезпечує точність профілювання метилювання на рівні провідних комерційних технологій, представлених на ринку, водночас дозволяючи одночасне високоточне визначення генетичних варіантів.

Вступ

Молекули ДНК містять кілька рівнів інформації, зокрема генетичні послідовності та епігенетичні модифікації, що робить їх за своєю природою мультиомними. Окрім чотирьох канонічних нуклеотидів, існує п’ята основа — метильований цитозин (рисунок 1). Метильовані цитозини є епігенетичними мітками, які функціонують як динамічні молекулярні сигнали, що модулюють експресію генів у відповідь на чинники довкілля, розвитку та клітинного стану.

Подібно до того, як генетичні варіанти надають інформацію про стан здоров’я, аберантні патерни метилювання можуть слугувати індикаторами захворювань. Поєднання генетичної та епігенетичної інформації підвищує роздільну здатність і чутливість порівняно з дослідженнями, що ґрунтуються лише на одному «-омному» рівні, розкриваючи нові біологічні дані.

Комерційно доступні методи профілювання метилювання, такі як bisulfite або EM-seq, перетворюють неметильовані цитозини на тимін, що призводить до вилучення більшості цитозинів із бібліотеки та формування геному з низькою складністю, який є складним для секвенування та вирівнювання. Метильовані цитозини потім визначаються на основі цитозинів, що залишилися неперетвореними. Хоча ці технології були фундаментальними інструментами у формуванні нашого сучасного розуміння метилювання ДНК, їм бракує достатньої точності для забезпечення високороздільного визначення генетичних варіантів.

Ми передбачили, що рішення, яке забезпечує виявлення обох типів варіантів в межах одного робочого процесу, суттєво прискорить наукові відкриття.

У цьому контексті ми представляємо інноваційне 5-base рішення, яке забезпечує профілювання метилювання та визначення генетичних варіантів у швидкому, простому та комплексному робочому процесі порівняно з альтернативними підходами (рисунок 2).

Примітка

1. Dual-omic on-market: Füllgrabe et al., 2023;
   On-market enzymatic: Vaisvila et al., 2021 (підготовка бібліотек) та Bismark;
   Bisulfite: xGen Methyl-Seq DNA Library Prep Kit (оцінено у березні 2025);
   WGS: Illumina DNA Prep;

Новітнє рішення

В основі 5-base рішення Illumina лежить новий, спеціально розроблений фермент, створений власними силами в Illumina для селективного та прямого перетворення метильованих цитозинів на готовий до секвенування тимін (рисунок 3). Мільйони варіантів білків були проаналізовані протягом ітеративних поколінь з метою ідентифікації білка з найвищою селективністю до метильованого цитозину та достатньою ефективністю, завдяки якій реакція оптимально відбувається лише за 30 хвилин.

Фундаментальною складовою 5-base рішення є високооптимізовані алгоритми Illumina DRAGEN, які виконують вирівнювання геному з урахуванням метилювання, кількісну оцінку метилювання та високоточне визначення варіантів в межах єдиного аналізу. Ключовою інновацією цього програмного забезпечення є здатність розрізняти цитозин, перетворений у результаті метилювання, та однонуклеотидний варіант (SNV) C>T шляхом використання інформації, закодованої в комплементарному ланцюзі ДНК.

Для метильованого цитозину пайплайн очікує, що комплементарною основою є гуанін, тоді як для варіанта C>T комплементарною основою є аденозин (рисунок 4). Рівень метилювання та частота алельного варіанта в окремій позиції цитозину визначаються на основі інформації, що міститься у рідах, які покривають обидва ланцюги.

Як це працює

Реакція перетворення метильованого цитозину є простим, інтегрованим етапом у межах високоефективного робочого процесу підготовки бібліотек на основі лігування. Робочий процес починається з екстрагованої, фрагментованої геномної ДНК (gDNA) або циркулюючої позаклітинної ДНК (cfDNA), після чого проводиться репарація кінців (end-repair), додавання А- нуклеотиду до 3` кінців (A-tailing) та лігування адаптерів.

Далі ДНК денатурують і інкубують із ферментом перетворення 5-метильованого цитозину для прямого перетворення метильованих цитозинів в одній реакції тривалістю менше ніж одну годину. Після перетворення зразки ампліфікують методом ПЛР та очищають за допомогою магнітних кульок для секвенування на стандартних секвенувальних платформах Illumina. Підготовка бібліотек є максимально оптимізованою та може бути завершена менше ніж за вісім годин. Хімія перетворення також сумісна з таргетним збагаченням шляхом гібридизаційного захоплення для застосувань із високою глибиною покриття, включаючи корекцію помилок на основі UMI (унікальних молекулярних ідентифікаторів).

Після завершення секвенування, вирівнювання, анотація метилювання та визначення варіантів можуть бути виконані за допомогою автоматизованого пайплайну аналізу «одним натисканням кнопки» менш ніж за одну годину. Отримані результати можуть бути додатково оброблені за допомогою програмного забезпечення для інтерпретації, зокрема Illumina Connected Multiomics та Emedgene.

Високоточне профілювання метилювання з меншим обсягом секвенування

У порівняльних дослідженнях 5-base рішення забезпечує профілювання метилювання з точністю, порівнянною із золотим стандартом методів перетворення метилювання. Хімія, що використовується забезпечує високі коефіцієнти перетворення метильованих цитозинів та дуже низький рівень позацільового перетворення неметильованих цитозинів, що підтверджено оцінкою з використанням метильованих і неметильованих контрольних геномів pUC та lambda (рисунок 6A).

Рівні метилювання, виміряні за допомогою 5-base рішення в межах CpG-острівців у геномах людини, є високо узгодженими зі значеннями, отриманими при перетворенні за допомогою EM-seq. Висока маповність 5-base бібліотек, що зумовлена перетворенням лише метильованих цитозинів, призводить до покриття більшої кількості CpG-сайтів за однакової глибини секвенування (рисунок 6C), що, своєю чергою, забезпечує вищу потужність виявлення при використанні 5-base рішення.

(A) 5-base рішення Illumina точно та специфічно перетворює метильовану контрольну ДНК (неметильована lambda: 0,5%, 0,4%, 0,9%; метильована pUC19: 95,0%, 96,4%, 94,7% для методів перетворення Bisulfite, EM-seq v1 та 5-base, виконаних із використанням підготовки бібліотек Illumina на основі лігування).

(B) Illumina 5-base демонструє високу кореляцію з EM-seq при порівнянні середніх рівнів метилювання в CpG-острівцях референсної ДНК NA12878.

(C) Кількість CpG-сайтів, захоплених із 500 мільйонів секвенованих пар рідів, для Illumina 5-base порівняно з перетворенням EM-seq v1. 27 мільйонів CpG-сайтів мають покриття 10× при використанні 5-base, порівняно з 22 мільйонами CpG-сайтів для EM-seq.

Одночасне виявлення генетичних варіантів з високою чутливістю

Хімії метилювання, які перетворюють неметильований цитозин на тимін, створюють труднощі для виявлення генетичних варіантів і зазвичай потребують окремої обробки стандартних секвенувальних бібліотек, якщо необхідно отримати інформацію про генетичні варіанти. 5-base рішення компанії Illumina усуває потребу у двох окремих підготовках бібліотек, забезпечуючи високороздільне виявлення варіантів у всіх чотирьох позиціях основ (A, T, G та C) на додачу до детекції метильованого цитозину в межах того самого секвенувального ріду.

За умови аналізу з використанням застосунків DRAGEN, доступних у Illumina BaseSpace Sequencing Hub або Illumina Connected Analytics, 5-base рішення забезпечує високоточне визначення малих варіантів — як варіантів зародкової лінії, так і соматичних (рисунки 7A, 7B). Крім того, технологія може бути поєднана з таргетним  гібридизаційним збагаченням для виявлення низькочастотних варіантів у зразках крові, свіжозамороженої тканини або cfDNA (рисунок 7B).

(A) Точність визначення гермінальних SNV для референсного зразка NA12878 за допомогою 5-base рішення Illumina (EM-seq та Bisulfite оброблені з використанням Bis-SNP, 5-base та WGS — з використанням DRAGEN) є порівнянною з WGS.

(B) Виявлення SNV з низькою частотою варіантного алеля (VAF) із застосуванням збагачення порівняно зі стандартним WGS зі збагаченням та колапсуванням UMI.

(A) Одночасне представлення на рівні рідів даних геному та метилому дозволяє виявити алель-специфічне метилювання зародкової лінії в одному алелі. На іншому алелі спостерігаються міссенс-мутація та відсутність метилювання — ознаки, які неможливо розрізнити лише за допомогою стандартного WGS.

(B) Обробка зразка ДНК від учасника дослідження рідкісного захворювання з використанням 5-base технології. Виявлення малих варіантів за допомогою аналізу гермінальної лінії Illumina DRAGEN ідентифікувало мутацію в гені KMT2D. Дані метилювання були оброблені за допомогою алгоритму класифікації епігенетичних захворювань, розробленого EpiSign. У сукупності мутація та епігенетична сигнатура класифікують захворювання як синдром Кабукі.

Матеріал є перекладом оригінальної статті компанії Illumina, опублікованої у відкритому доступі та доступної за посиланням

https://www.illumina.com/science/genomics-research/articles/5-base-solution.html

Переклад виконано з максимальним збереженням змісту, термінології та структури оригіналу.